分光光度法是在特定波長處或一定波長范圍內光的吸收度,對該物質進行定性或定量分析。常用的波長范圍為:(1)200~380nm的紫外光區,(2)380~780nm的可見光區,(3)2.5~25μm(按波數計為4000cm<-1>~400cm<-1>)的紅外光區。所用儀器為紫外分光光度計、可見光分光光度計(或比色計)、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計
可見分光光度計測量范圍一般包括波長范圍為380~780 nm的可見光區和波長范圍為200~380 nm的紫外光區。不同的光源都有其*的發射光譜,因此可采用不同的發光體作為儀器的光源。
可見分光光度計可應用于核酸的定量、蛋白質的直接定量、細菌細胞密度測量等。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能??梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構成不一,因此其換算系數不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對應的系數。
蛋白質的直接定量(UV法)
這種方法是在280nm波長,直接測試蛋白。選擇Warburg 公式,光度計可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應的換算方法,將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單,先測試空白液,然后直接測試蛋白質。
細菌細胞密度(OD 600)
實驗室確定細菌生長密度和生長期,多根據經驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗,需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養物中微生物生長的標準方法。
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