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　　1.什么是瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染?

　　瞬時轉(zhuǎn)染：外源片段的表達時間短暫。這主要是因為外源導(dǎo)入的裸露的載體整合入基因組的幾率非常低，所以以染色體外(episomal)形式存在，不能隨細胞分裂而一同復(fù)制導(dǎo)致最后拷貝數(shù)被稀釋導(dǎo)致的。而且考慮到細胞分裂會稀釋質(zhì)粒的量，所以起初轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒拷貝數(shù)極gao。這就導(dǎo)致瞬時轉(zhuǎn)染呈現(xiàn)一個高拷貝到低拷貝迅速降低的過程，且無法在這個系統(tǒng)上實現(xiàn)可誘導(dǎo)表達。

　　穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：是相對瞬時轉(zhuǎn)染而言，進入細胞的質(zhì)粒整合入細胞基因組中，并能隨細胞分裂穩(wěn)定傳遞下去。在這個系統(tǒng)中，質(zhì)粒表達穩(wěn)定，拷貝數(shù)低，且能實現(xiàn)誘導(dǎo)表達。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并不是一種與瞬時轉(zhuǎn)染不同的方法，只是對瞬時轉(zhuǎn)染的細胞進行篩選，得到穩(wěn)定整合的細胞株。穩(wěn)定整合的幾率因基因傳遞的方法而異，跨度可以從10-8到10-1.因此，對于有的轉(zhuǎn)染方法，比如化學(xué)試劑介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，其整合幾乎可以忽略不計。質(zhì)粒載體整合的位點并不是wan全隨機分布，依據(jù)不同的基因傳遞方法，呈現(xiàn)不同的靶向傾向性，所以是一種半隨機整合。

　　2.設(shè)計穩(wěn)定株構(gòu)建實驗需要考慮的因素有哪些?

　　穩(wěn)定整合試驗中需要考慮的幾個關(guān)鍵因素有：

　　1)，外源插入片段的拷貝數(shù)。多數(shù)情況下，低拷貝甚至是單拷貝可以減少人為實驗因素的干擾。

　　2)，整合的幾率，這不僅決定了穩(wěn)定株篩選的難易程度，而且還可以幫助人們更容易得到混合穩(wěn)定株。

　　3)，整合位點的轉(zhuǎn)錄活躍度，決定了穩(wěn)定株中外源片段的表達質(zhì)量。最li想的狀況是單拷貝，但轉(zhuǎn)錄活性比較高。

　　4)，整合后的穩(wěn)定性。不同的整合位點決定了外源片段在染色體中的穩(wěn)定性，有些區(qū)域易發(fā)生重組或者丟失，從而導(dǎo)致穩(wěn)定株再次丟失的情況。

　　5)，zui,好使用混合穩(wěn)定株或者獲得多個不同單克隆穩(wěn)定株。因為穩(wěn)定整合往往伴隨這插入失活宿主內(nèi)源基因，所以實驗時通過使用混合穩(wěn)定株，或者對多個單克隆穩(wěn)定株進行比較，可以幫助研究人員獲得更精確的實驗數(shù)據(jù)。

　　3. 什么時候需要穩(wěn)定細胞株?

　　以下實驗，構(gòu)建穩(wěn)定細胞株而不是瞬時轉(zhuǎn)染更能滿足實驗要求：

　　1)，外源片段在分裂細胞中長期(>2周)穩(wěn)定表達。雖然普通轉(zhuǎn)染實驗一般只能保證2-4天的轉(zhuǎn)染和表達效率，但腺病毒載體在多數(shù)分裂細胞中可以維持2-4周內(nèi)的高轉(zhuǎn)染效率和表達周期。而非分裂細胞，可以使用腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因，因為腺相關(guān)病毒載體在許多非分裂細胞中可以保持長達1年的高效表達。

　　2)，需要構(gòu)建使用誘導(dǎo)表達系統(tǒng)，這主要是由于：a)，過表達基因或者干擾目的基因引起細胞毒性或者抑制細胞生長等不利因素; b)，目的基因的過表達或者干擾需要時空特異性。

　　3)，希望控制目的基因過表達或者干擾的拷貝數(shù)，以避免引入人為因素影響實驗結(jié)果的精確性。構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選拷貝數(shù)適量的細胞進行實驗研究。

　　4)，部分細胞種類，病毒載體亦無法達到高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，通過構(gòu)建穩(wěn)定株，達到外源片段的高效表達。

　　5)，長期在少數(shù)幾類細胞中研究幾個基因的功能，通過構(gòu)建穩(wěn)定株，可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本，也極大方便實驗研究。

　　6)，部分蛋白穩(wěn)定性ji強，瞬時RNA干擾因為作用周期短，只能抑制目的基因的表達，但無法去除已經(jīng)表達的目的蛋白，所以需要通過構(gòu)建穩(wěn)定株實現(xiàn)更好的基因干擾效果。

　　7)，需要往動物體內(nèi)注射表達有外源片段的細胞。需要構(gòu)建穩(wěn)定細胞株，以防止注射入動物體內(nèi)后，很快外源片段表達丟失。

　　8)，細胞個體差異(同一類細胞，不同個體細胞基因組存在差異)對實驗結(jié)果有干擾，需要構(gòu)建單克隆細胞株去除干擾。

　　9)，需要將外源片段插入基因組中，比如基因敲除，基因插入突變篩選等修飾基因組的實驗。

　　4. 什么時候不需要構(gòu)建穩(wěn)定株?

　　以下實驗不需要構(gòu)建穩(wěn)定株：

　　1)，希望迅速觀察目的基因過表達或者干擾效果。例如在正式實驗之前進行的小規(guī)模預(yù)實驗。

　　2)，2-4天的瞬時表達已經(jīng)可以達到具體的實驗?zāi)康模热鐧z測兩個外源轉(zhuǎn)染的目的蛋白之間的相互作用，或者觀察某些細胞周期抑制，凋亡或細胞存活相關(guān)基因的細胞表型。

　　3)，細胞個體差異對實驗結(jié)果有影響。體外培養(yǎng)非原代細胞，多為轉(zhuǎn)化細胞系或者癌細胞，細胞個體差異大，瞬時轉(zhuǎn)染或者使用腺病毒/腺相關(guān)病毒載體進行轉(zhuǎn)導(dǎo)更可以反映細胞群體行為。或者使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建混合穩(wěn)定株。

　　5. 病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定細胞株有什么優(yōu)勢?

　　化學(xué)試劑介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法和電轉(zhuǎn)，整合率低，同時整合位點不穩(wěn)定，易發(fā)生再次丟失的情況，而且整合位點一般都在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)之外，所以并不是理想的穩(wěn)定整合工具。另外，整合后的拷貝數(shù)是由核內(nèi)的外源DNA局部濃度，而不是轉(zhuǎn)染時的DNA的量決定，而化學(xué)方法在輸入質(zhì)粒載體入核的效率比電轉(zhuǎn)和病毒載體相比要低得多，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染相同細胞所用質(zhì)粒載體用量要大大高于其它方法，造成入核質(zhì)粒載體量難以控制，這也解釋了為什么化學(xué)轉(zhuǎn)染方法和其它兩種方比，更傾向于得到串聯(lián)多拷貝。以上種種因素，導(dǎo)致使用非病毒載體轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建穩(wěn)定株，成功率低，穩(wěn)定性差，穩(wěn)定克隆株易出現(xiàn)不均一(含有非整合細胞)等缺點。

　　逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由于整合率高，是非常理想的穩(wěn)定株構(gòu)建工具。而且通過控制逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的實驗條件，理論上可以確保每個細胞只有單拷貝插入。同時由于病毒載體是通過病毒重組酶將外源片段整合入染色體中，其整合特性和病毒自身整合特性非常相似：偏向于轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)段，且整合后非常穩(wěn)定，在傳代100次后仍然保留在宿主基因組中。最重要的是整合幾率和所有其它化學(xué)，物理轉(zhuǎn)染方法比，增加5至6個數(shù)量，使得穩(wěn)定株構(gòu)建不再成為實驗研究的障礙。由于整合幾率非常高，所以很容易獲得混合穩(wěn)定株。

　　腺病毒載體整合率和普通轉(zhuǎn)染方法差異不大，被認為是不能整合的一類病毒載體，因此相關(guān)研究數(shù)據(jù)較少，不建議用來構(gòu)建穩(wěn)定株。非野生型腺相關(guān)病毒載體(Rep-)整合率較低，但因為野生型病毒載體可以定點將病毒基因組整合于人19號染色體，所以從安全性和穩(wěn)定性角度來說，潛力都非常巨大。由于諸多因素，研究人員仍然在對其進行改造中，包括考慮到嚙齒類動物不含有人19號染色體對應(yīng)的整合位點序列。

　　6. 篩選穩(wěn)定細胞株的方法主要有哪些?

　　主要有三類方法：

　　1)單克隆環(huán)法：此類方法多用于整合率低的轉(zhuǎn)染方法或者需要得到單克隆細胞株的實驗。其優(yōu)點在于工作量小，只需將轉(zhuǎn)染或者病毒載體感染后的細胞按照一定的細胞密度轉(zhuǎn)移至新皿中，并使用合適的藥物進行篩選，最后在克隆環(huán)的幫助下對單克隆細胞株進行挑選，并在新皿中完成擴增。缺點在于需要對細胞密度和藥物濃度繪制致死曲線并選取合適的細胞密度和藥物濃度進行篩選，一些細小的密度和濃度差別都會導(dǎo)致難以獲取均一的單克隆，結(jié)果導(dǎo)致獲取的克隆不純，含有非整合的細胞。穩(wěn)定整合的細胞在這樣一類混合細胞中，很快會失去生長優(yōu)勢，最終導(dǎo)致失去穩(wěn)定株。 2)96孔單克隆稀釋法：此類方法同樣多用于整合率低的轉(zhuǎn)染方法或者需要得到單克隆細胞株以及篩選懸浮細胞穩(wěn)定株的實驗。其優(yōu)點在于，理論上可以得到非常均一的單克隆，同時可以篩選懸浮細胞穩(wěn)定株。其缺點在于，工作量比較大。

　　3)逆轉(zhuǎn)錄病毒混合克隆制備法：此類方法適用于需要制備混合穩(wěn)定株。優(yōu)點在于可以在短時間內(nèi)(1周)獲得穩(wěn)定細胞株，同時也可以隨時將細胞稀釋轉(zhuǎn)移至新皿中獲得單克隆細胞株。缺點在于需要制備逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

　　7 為什么常規(guī)轉(zhuǎn)染方法篩選穩(wěn)定株異常困難?

　　常規(guī)化學(xué)轉(zhuǎn)染或者電轉(zhuǎn)方法，其整合是非同源重組隨機整合，幾率非常低(10-8-10-6) ，且這些轉(zhuǎn)染條件下發(fā)生的整合多發(fā)生在轉(zhuǎn)錄非活躍區(qū)或者重復(fù)序列區(qū)，導(dǎo)致外源片段表達效率低，同時這些整合常常不穩(wěn)定，隨著傳代次數(shù)的增加，即使在有壓力選擇的情況下也容易發(fā)生丟失。

　　8.為什么病毒載體介導(dǎo)的穩(wěn)定株篩選方法效率要比常規(guī)方法高?

　　逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的染色體整合依賴于病毒重組酶，是一個酶催化反應(yīng)，因此效率相比隨機整合要高多個數(shù)量級。而且整合位點多位于轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，因此表達效率高。同時其整合非常穩(wěn)定，連續(xù)傳代100代以上仍然保持穩(wěn)定表達。

　　9. 如何選擇適合的病毒包裝類型進行穩(wěn)定株篩選?

　　并非所有的病毒載體都適合用來進行穩(wěn)定株篩選，首先需要挑選整合效率高，整合位點穩(wěn)定的病毒載體。至今為止，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是最you效的可以介導(dǎo)基因整合的病毒載體。其次，依據(jù)具體實驗要求，挑選不同整合位點傾向性的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。傾向于整合于轉(zhuǎn)錄起始位點附近的，容易造成下游基因的激活; 而整合于轉(zhuǎn)錄活躍基因內(nèi)的，容易導(dǎo)致整合區(qū)基因的插入失活。

　　10. 病毒載體介導(dǎo)的穩(wěn)定株篩選方法可以適用于任何靶細胞嗎?

　　雖然普通的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以用來進行穩(wěn)定株的構(gòu)建，然而這一類病毒載體并不能高效感染非分裂細胞，因此對于這一類分化細胞，可以使用慢病毒載體進行穩(wěn)定株構(gòu)建。也可以使用腺相關(guān)病毒載體高效感染非分裂細胞，這一類病毒載體雖然整合率低于慢病毒載體，但其可以以染色體外形式長期(數(shù)月至數(shù)年)存在于非分裂細胞中，因此可以避免進行穩(wěn)定株篩選。

　　11. 為什么穩(wěn)定株構(gòu)建服務(wù)中不使用腺病毒載體?

　　腺病毒載體由于其整合幾率極低，被普遍認為是不具備整合能力的病毒載體，所以一般不用來進行穩(wěn)定株構(gòu)建。

　　12. 單克隆穩(wěn)定株和混合克隆穩(wěn)定株有什么區(qū)別?我該選擇哪一類用于我的實驗?

　　單克隆穩(wěn)定株顧名思義來源于含有穩(wěn)定整合外源片段的單個細胞的擴增，而混合穩(wěn)定株則由多個單克隆穩(wěn)定株構(gòu)成的克隆群，不同的單克隆其外源片段的整合位點不一樣。由于體外細胞多屬于細胞系，其基因組呈現(xiàn)不穩(wěn)定的特點，因此即使是同類細胞，不同細胞個體基因組背景都存在差異。當需要去除細胞群體干擾因素的時候，推薦使用單克隆穩(wěn)定細胞株，其基因組背景相對單一，對實驗結(jié)果干擾因素小。當進行系統(tǒng)生物學(xué)研究時，多考慮這類因素。同時也是由于不同細胞個體差異大，而且不同整合位點的單克隆細胞株表現(xiàn)出來的細胞行為可能不一致，所以許多實驗使用混合克隆株更能去除細胞間差異造成的干擾。混合穩(wěn)定株可以通過逆轉(zhuǎn)錄病毒直接篩選獲得，或者通過講眾多不同的單克隆穩(wěn)定株混合獲得。前者無論是是從質(zhì)量，還是時間周期來看都更好。

　　13. 怎么判別篩選的穩(wěn)定株是單克隆?

　　1)，如果外源片段含有熒光標記，可以直接使用流式細胞儀檢測其熒光是否均一; 如果還有其它標簽，可以進行免疫熒光標記，再使用流式細胞儀觀察熒光分布是否出現(xiàn)均一峰值。因為不同單克隆由于整合位點不一樣，其表達強度也會受附近染色體結(jié)構(gòu)的影響，出現(xiàn)差異。

　　2)，如果外源片段不含任何標簽或者熒光標記，則可以使用分子生物學(xué)比如Southern Blot的方法鑒定。

　　3)，使用96孔板稀釋法篩選，得到的陽性克隆一般是單克隆。因為最初如果混有非整合細胞，則含有整合外源片段的單細胞多半會失去生長優(yōu)勢，無法得到陽性克隆。使用單克隆環(huán)法，如果挑取的是致密，單一的克隆，那么多半也是單克隆。

　　14.如何判別篩選的穩(wěn)定株是100   ，%含有外源整合片段的細胞群?

　　通過觀察所攜帶的熒光標記或者對外源插入片段進行免疫熒光標記可以判斷穩(wěn)定株是否混有非整合細胞。

　　15.為什么有的時候構(gòu)建RNAi穩(wěn)定株對達到高效的基因干擾效果是必須的?

　　RNA干擾效應(yīng)主要是影響目的基因所表達的mRNA的穩(wěn)定性或者翻譯，并不影響已經(jīng)存在的目的蛋白的狀態(tài)。部分蛋白其穩(wěn)定性異常高，即使mRNA的表達水平或者翻譯受到干擾，目的蛋白仍然可以在很長一段時間內(nèi)發(fā)揮功能。因此需要進行穩(wěn)定株篩選，以挑取干擾效果好的細胞克隆進行實驗。在一些極duan情況下，甚至需要進行第2輪穩(wěn)定株篩選，才能獲得一個比較好的RNA Knock down細胞株。