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Anika Manzke是病毒清除產(chǎn)品經(jīng)理，Birte Kleindienst是病毒清除產(chǎn)品初級經(jīng)理，二人均供職于Sartorius Stedim Biotech
細(xì)菌、支原體和病毒等各種感染因子對生物反應(yīng)器的污染會對患者安全構(gòu)成潛在的威脅。近年來，病毒一直是導(dǎo)致多種生物反應(yīng)器污染的原因(1)。許多生物制藥公司已經(jīng)報告過鼠細(xì)小病毒(MVM)或皰疹病毒屬(2)等無包膜細(xì)小病毒對生產(chǎn)級生物反應(yīng)器造成的污染。制藥行業(yè)中的許多重量級公司都加入了CAACB來共同解決這一問題。
制造商可以采取多種方法降低細(xì)菌或支原體引起的細(xì)胞培養(yǎng)污染風(fēng)險。但是，病毒(特別是無包膜細(xì)小病毒)引起的污染風(fēng)險，即使是在使用化學(xué)限定培養(yǎng)基(1)的情況下，對生物制藥行業(yè)而言仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。
傳統(tǒng)的除菌級過濾器,即使是0.1微米的過濾膜都不能防止無包膜微小病毒造成的污染。
病毒污染比細(xì)菌污染(3)更難以檢測。未能檢測到的病毒可能會污染整個下游過程，甚至是終藥品。許多公司因鼠細(xì)小病毒或皰疹病毒屬(2)污染而遭受了生產(chǎn)損失。針對所有上述情況，根源分析顯示，可能的源頭是在供應(yīng)鏈(4-6)早期儲存過程中的培養(yǎng)基組分(如鹽)污染。
圖1：病毒污染事件的逐漸升級關(guān)聯(lián)效應(yīng)
防止老鼠進入這些倉庫的措施不夠充分。
這些污染事件可能對患者造成致命的后果。
這些無包膜病毒的穩(wěn)定性高，因此它們可以長期存活。即使是一個感染性顆粒也會污染整個生物反應(yīng)器。這一個顆粒會在生物反應(yīng)器中迅速復(fù)制。在它進入生物反應(yīng)器之前，要在1000 L的培養(yǎng)基中找出這一個顆粒無異于大海撈針。
污染影響
這種污染事件可能對患者造成致命的后果(參見圖1)。如果公司發(fā)現(xiàn)存在污染，不僅需要關(guān)閉工廠，還需要進行大量的清潔工作。由此便可能導(dǎo)致藥物短缺，患者不能獲得救生藥物(7)。
上游病毒清除解決方案
上游工藝中需要有新的病毒清除理念。
過去，研究人員已經(jīng)研究了伽馬輻射、UV-C照射或高溫短時處理(HTST)等技術(shù)去除細(xì)胞培養(yǎng)基病毒的能力。如牛血清在伽馬照射下能清除大部分的病毒(8)。高溫短時處理需要大量投資，因此它僅在高流速下處理大量培養(yǎng)基時才是經(jīng)濟可行的(9)。然而，并非所有培養(yǎng)基組分都是熱穩(wěn)定的，而高溫短時處理系統(tǒng)線性放大也并非易事。UV-C受限于可應(yīng)用的流速，因此在制備大體積的培養(yǎng)基時應(yīng)用有限。此外，從這些公開發(fā)布的方法數(shù)據(jù)來看，這些技術(shù)在滅活無包膜細(xì)小病毒方面的效果也良莠不齊。迄今為止，過濾這項有效的技術(shù)(對無包膜病毒特別有效)尚未被廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基過濾(10)。
下游病毒過濾器的瓶頸
為達(dá)到理想的病毒清除效果，一些公司已經(jīng)采用下游工藝中的除病毒過濾器來進行培養(yǎng)基的過濾制備，以此盡量減少病毒污染的風(fēng)險。因為生產(chǎn)時間長，流速低，所以公司可有效地將這些過濾器用于過濾灌注生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基中的潛在病毒。采用傳統(tǒng)的下游工藝(DSP)過濾器過濾化學(xué)限定培養(yǎng)基時，培養(yǎng)基的過濾載量相當(dāng)高，能高達(dá)10.000 L/m²(11)。
如果可以在幾天內(nèi)而非數(shù)小時內(nèi)過濾這些培養(yǎng)基，傳統(tǒng)的DSP過濾器則是的解決方案，而且經(jīng)濟上可行，因為小過濾面積已經(jīng)足以滿足需求。然而，在傳統(tǒng)的批量過濾中，情況并非如此。由于細(xì)菌污染的風(fēng)險，培養(yǎng)基必須在至少24小時內(nèi)過濾，且理想情況下是在一個班次內(nèi)。為了提高過濾的整體速度，則需要更大的過濾面積，但這種方法成本昂貴，在經(jīng)濟上不可行。
經(jīng)濟上的可行方案
生物制藥行業(yè)需要解決將下游工藝除病毒過濾器用于上游培養(yǎng)基除病毒過濾的低流速和高成本問題，使其在經(jīng)濟上可行。這是開發(fā)專門用于培養(yǎng)基過濾(10)的代病毒截留過濾膜的背景。
方法
截留性能
每個5.0cm2的實驗室用除病毒濾器都經(jīng)過了病毒挑戰(zhàn)實驗. 實驗采用了作為“差條件”下的非脂包膜指示病毒-MVM 。它是細(xì)小病毒家族的12-26納米單鏈無包膜ssDNA病毒。實驗使用5.0cm2的除病毒濾器，在2.0bar的恒定壓力下過濾3種不同的培養(yǎng)基，并進行二次重復(fù)實驗。在1%的病毒加入量下，過濾了400 L/m²。
膜載量測試
膜過濾載量采用了三個不同供應(yīng)商的15種不同培養(yǎng)基來測定。所有測試均在2.0bar的恒壓下進行。
表1：新型除病毒培養(yǎng)基濾器的截留能力，實驗室用濾器(5 cm2)。
圖2：在4小時的過濾時間內(nèi)，15種細(xì)胞培養(yǎng)基(CCM)在恒壓2.0bar下的通過量一覽；培養(yǎng)基除病毒過濾器，實驗室用。
4小時過濾后對總過濾量進行了測量。
結(jié)果
截留性能
表1總結(jié)了使用新型膜進行測試的截留數(shù)據(jù)。膜的病毒截留性能同下游工藝應(yīng)用中使用的過濾器相當(dāng)。無包膜細(xì)小病毒MVM的截留量超過4個對數(shù)值。分析方法檢測不到濾液中的MVM。可合理預(yù)期該膜會截留比細(xì)小病毒更大的潛在污染因子。
不同化學(xué)限定成分細(xì)胞培養(yǎng)基的膜通過量
膜的通過量采用了三個不同供應(yīng)商的15種培養(yǎng)基來測定。圖2表明了在2bar壓力下，4小時的培養(yǎng)基處理載量因培養(yǎng)基組分不同而差別很大。例如，Lonza Power CHO2相對較快地造成了膜堵塞，而Lonza ProPER1培養(yǎng)基似乎*不堵膜。
對于一些商業(yè)化細(xì)胞培養(yǎng)基，使用串聯(lián)0.1微米過濾器顯著提高了除病毒過濾膜載量(7)。但僅部分培養(yǎng)基可行，有些則沒起作用。諸如泊洛沙姆等保護劑大幅降低了過濾流速(10)。
對于一些商業(yè)化細(xì)胞培養(yǎng)基，使用串聯(lián)0.1微米過濾器顯著提高了膜通過量。
降低泊洛沙姆濃度或在添加至培養(yǎng)基以前過濾能大幅提高過濾器的過濾量。業(yè)界應(yīng)該展開更多研究，從而充分了解不同培養(yǎng)基組分對培養(yǎng)基過濾器過濾性能的影響。根據(jù)本研究，可設(shè)計出一種既能改善過濾性能又不影響后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)工藝的培養(yǎng)基。不過，研究表明，在細(xì)胞培養(yǎng)基通常的4小時過濾中，開發(fā)的新膜通常過濾載量約1000 L/m2。因此，對于批量制備培養(yǎng)基，這種新膜是經(jīng)濟上可行的辦法，同時也降低了細(xì)胞培養(yǎng)基的病毒污染風(fēng)險。
結(jié)論
在本文中，作者介紹了一種新的病毒截留膜，上游工藝工程師可使用它來過濾化學(xué)限定培養(yǎng)基，從而降低風(fēng)險。此外，作者已經(jīng)證明該方法可截留4個Log以上的非包膜細(xì)小病毒。當(dāng)過濾一系列不同型號的化學(xué)限定培養(yǎng)基時，該膜的通量較高，生物制藥公司能夠在上游工藝中使用這種膜，而且不會對工藝成本造成不利的影響。該膜有可能成為基于風(fēng)險控制來zui大程度地降低病毒污染事件的重要環(huán)節(jié)，同時提高生物制藥公司的生產(chǎn)能力。
REFERENCES
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2. Bethencourt, Nature Biotechnology 27, 681 (2009), nature。。com/nbt/journal/v27/n8/full/nbt0809-681a
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5.Jim Skrine, “A Biotech Production Facility Contamination Case Study–Minute Mouse Virus,” PDA/FDA Adventitious Viruses in Biologics: Detection and Mitigation Strategies Workshop, Bethesda, Maryland, Dec. 1-2, 2010.
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9.B. Hansmann, V. Thom, A. Manzke, “Contamination Risk Mitigation in Cell Culture Media Preparation,” Virus & TSE Safety Forum, Lisabon, June 9-11, 2015.
10.A. Meyer, “Risk Mitigation in Media Preparation—Current Possibilities and Future Trends,” PDA Virus & TSE Safety Forum, Berlin, June 5, 2013.
Thomas R. Kreil, “Virus Safety—A Look into the Entire Process Raw Materials, Upstream, Downstream,” European Upstream and Downstream Technology Forum Goettingen, September 8-10, 2014. ◆
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